1材料、仪器及试剂 1.1材料 1.2仪器 Acquity UPLC SynaptG2 HDMS系统(美国Waters公司，包括真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器和ESI电离源Q-TOF检测器)。Dionex UitiMate 3000(Thermo Fisher科技有限公司)，AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，数控超声波清洗器(KQ5200DE型，40 kHz，昆山市仪器超声有限公司)，微孔滤膜0.22 μm(天津津腾有限公司)，BJ150型高速多功能粉碎机(浙江湖州德清拜杰电器有限公司)。 1.3试剂 2方法 2.1样品溶液的制备 苹果属植物叶片阴干，粉碎，精密称取约0.1 g样品粉末，放至10 mL量瓶中，加入适量70%乙醇作为提取溶剂，超声30 min后冷却至室温，再加入70%乙醇定容至刻度，摇匀，静置。吸取上清液用0.22 μm微孔膜滤过，取续滤液至液相小瓶中备用。 2.2对照品溶液的制备 分别精密称取根皮苷20.30 mg、三叶苷5.60 mg、根皮素5.10 mg、芦丁9.50 mg和槲皮苷10.10 mg于10 mL量瓶中，加入适量甲醇溶解后定容至刻度，摇匀，静置，作为储备液。使用前分别精密量取适量体积的上述对照品溶液，混合，摇匀，作为混合对照品溶液。 2.3UPLC-DAD色谱条件 Waters BEH C 18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)。流动相为1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，柱温为40 ℃，体积流量为0.3 mL/min。洗脱程序:0~8 min，15%~35% B;8~10 min，35%~50% B;10~11 min，50%~100% B;11~12 min，100% B;12~13 min，100%~15% B;13~16 min，15% B。进样体积2 μL，检测波长280 nm。 2.4线性关系考察 精密量取“2.2”项下混合对照品溶液适量，用甲醇作溶剂依次稀释，配制成一系列质量浓度梯度溶液。按照“2.3”项下色谱条件测定，并以质量浓度为横坐标(X)，峰面积响应值为纵坐标进行线性回归，得到槲皮苷、根皮素、根皮苷、三叶苷和芦丁的线性回归方程，见表2。 2.5定量测定 按照“2.3”项下色谱条件测定样品，并按照“2.4”项下线性回归方程分别计算样品中槲皮苷、根皮苷、根皮素、芦丁和三叶苷的量。 2.6UPLC-Q-TOF-MS检测条件 2.1 mm，1.7 μm)。流动相为1%甲酸水(A)-乙腈(B)，柱温为30 ℃，体积流量0.3 mL/min。洗脱程序为0~3 min，2%~4% B;3~4 min，4%~13% B;4~6 min，13%~15% B;6~7 min，15%~21% B;7~9 min，21%~22% B;9~10 min，22%~25% B;10~15 min，25%~60% B;15~16 min，60%~80% B。进样体积2 μL。 2.6.2质谱条件 采用电喷雾正离子和负离子检测电离模式，雾化气为高纯度N 2，碰撞气为高纯度He，质量扫描范围:m/z 100~1 200。负离子模式锥孔电压40 V，毛细管电压2.4 kV，离子源温度100℃，脱溶剂气温度350 ℃，脱溶剂气体积流量900 L/h，锥孔气体积流量50 L/h，碰撞能量(CE)20~40 eV，LockMass:亮氨酸脑啡肽，m/z为554.261 5。正离子模式锥孔电压40 V，毛细管电压3.5 kV，离子源温度100℃，脱溶剂气温度350 ℃，脱溶剂气体积流量900 L/h，锥孔气体积流量50 L/h，CE 20~40 eV，LockMass:亮氨酸脑啡肽，m/z为556.277 1。 2.7数据处理 将UPLC检测得到的样品数据导入SPSS(22.0版本)进行组间含量差异分析和整体聚类分析。将经超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-Q-TOF/MS)得到的样品数据导入Waters Masslynx 4.1软件中，在MakerLynx application managerVersion 4.1编辑，进行峰识别、峰对齐、基线校正和归一化等预处理，再将处理过的数据导入Progenesis QI(美国Waters公司)软件中，输出三维数据矩阵(由保留时间、精确相对分子质量和峰面积组成)，最后将得到的矩阵导入Simca-P软件(13.0版本)进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析，对不同种系和不同产地的苹果属植物进行模式识别，寻找组间差异较大的植物代谢物。 3结果与分析 3.1UPLC检测分析结果 样品含量测定结果表明(表3)，苹果属植物叶片中普遍含有根皮苷。槲皮素、根皮素和芦丁也广泛存在，三叶苷则只存在于少部分样品中。根皮苷量最高的是红花丽江山荆子(pgs-07)，达17.15%;根皮素量最高的是山荆子(pgs-49)，为0.11%;槲皮苷量最高的是锡金海棠(pgs-11)，为0.16%;芦丁量最高的是小金海棠(pgs-46)，为0.47%;三叶苷量最高的是湖北海棠(pgs-10)，为1.50%。 用SPSS(22.0版本)计算苹果属植物叶片样本各组中5种成分含量分布范围，并对不同组系及不同产地的5种成分含量进行了组间含量差异分析，其结果显示(表4)，样本中山荆子系中的5种成分含量均明显高于苹果系，苹果系中未能检测到三叶苷的存在;真正苹果组中的根皮苷、槲皮苷和芦丁含量高于花楸苹果组，但花楸苹果组的三叶苷含量高于真正苹果组，2组植物叶片中的根皮素含量相近;栽培种植物叶片中未检测到三叶苷存在，其他4种成分在野生种和栽培种中含量分布相近;来自北京市的样本三叶苷含量明显高于来自辽宁省兴城市的样本，其他4种成分在2个产地的植物叶片中含量分布相近。
文章来源：《植物研究》 网址: http://www.zwyjzz.cn/zonghexinwen/2020/1014/502.html
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